寡核苷酸療法是一種新興的治療方式，通過(guò)專門設(shè)計(jì)合成修飾的RNA或RNA/DNA 雜交體，以改變RNA和/或蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控疾病基因轉(zhuǎn)錄，被美國(guó)食品藥品管理局（FDA）或歐盟批準(zhǔn)用于治療罕見病。近年來(lái)，寡核苷酸藥物取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，截至2022年1月，全球已獲批上市的小核酸藥物共有14款，包括4款小干擾RNA（siRNA）藥物，9款反義寡核苷酸（ASO）和1款核酸適配體(Aptamer)（行研報(bào)告 小核酸藥物行業(yè)，36，2022.1.11）。截至目前，有超50款處于臨床實(shí)驗(yàn)階段。
FDA于2022年6月出臺(tái)了《Clinical Pharmacology Considerations for the Development of Oligonucleotide Therapeutics Guidance for Industry》，提供了幫助行業(yè)開發(fā)寡核苷酸療法的建議，涉及藥代動(dòng)力學(xué)、藥理學(xué)和安全性評(píng)估?！吨改稀肪秃螘r(shí)進(jìn)行這些評(píng)估以及何種類型的評(píng)估適合解決哪些問(wèn)題提供了建議。
為了滿足寡核苷酸藥物的研發(fā)需求，匯智泰康憑借多年來(lái)在生物醫(yī)藥研發(fā)、生物安全評(píng)價(jià)和分析檢測(cè)領(lǐng)域積累的技術(shù)、方法和項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，開發(fā)了針對(duì)寡核苷酸藥物的血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)方法，構(gòu)建了寡核苷酸藥物的臨床前藥物研發(fā)服務(wù)體系，可以承接寡核苷酸藥物臨床前實(shí)驗(yàn)相關(guān)研究工作，具體描述如下：
1.血漿蛋白結(jié)合率（plasma protein binding，PPB）試驗(yàn)
PPB通過(guò)檢測(cè)藥物入血后與血漿蛋白結(jié)合形成結(jié)合態(tài)藥物的比例，判斷藥物在血漿中的存在形式，為藥物作用機(jī)理研究、藥物活性研究、用藥方法研究等提供參考數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程包括：RNA與蛋白結(jié)合孵育過(guò)程，游離藥物分離過(guò)程（可根據(jù)藥物特點(diǎn)選用平衡透析法（ED）、超濾法（UF）、固相萃取法（SPE）等），和游離藥物檢測(cè)（可選用高效液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS、LC-MS/MS）、熒光標(biāo)記RNA的液相色譜-熒光檢測(cè)（LC-FLD）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)法等。血漿可以根據(jù)需要選擇人、猴、犬、大鼠、小鼠等不同種屬。
圖1 RNA蛋白結(jié)合率試驗(yàn)過(guò)程示意圖
圖2 某RNA-熒光標(biāo)記物的色譜圖
2.體外藥物代謝實(shí)驗(yàn)
體外代謝研究可通過(guò)直接考察候選化合物與受試靶點(diǎn)的選擇性作用，主要涉及代謝產(chǎn)物鑒定、代謝穩(wěn)定性、以及藥物代謝性相互作用等。代謝產(chǎn)物鑒定，可通過(guò)LC-MS/MS和高分辨質(zhì)譜（Triple QTOF-MS）進(jìn)行分子量鑒定，進(jìn)而推斷代謝路徑。
代謝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，如血漿代謝穩(wěn)定性、肝微粒體代謝穩(wěn)定性、肝細(xì)胞代謝穩(wěn)定性等，均可涉及人、猴、犬、大鼠、小鼠等多個(gè)種屬。對(duì)于血漿代謝穩(wěn)定性，可以通過(guò)LC-MS/MS測(cè)定從血漿中提取（可采用Trizol提取法、蛋白K酶消解法、固相萃取法、磁珠雜交提取法等）得到的RNA。對(duì)于肝微粒體代謝和肝細(xì)胞代謝，可以先應(yīng)用LC-MS/MS和Triple QTOF-MS對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，進(jìn)而應(yīng)用LC-MS/MS進(jìn)行定量分析。
藥物代謝性相互作用研究，可根據(jù)國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布的《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見稿）》開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)和研究。
3.動(dòng)物藥理藥效安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)
可開展大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、兔、猴、小型豬、犬等臨床前研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
匯智泰康寡核苷酸藥物研發(fā)相關(guān)配套儀器設(shè)備：
- 核酸電泳儀（BAYGENE-BG-POWER 600 等）
- PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)伯樂(lè)T100 等）
- 酶標(biāo)儀（美國(guó)博騰ELx808等）
- 蛋白純化儀（利穗科技APPS 50D等）
- 一體化凝膠成像儀（北京賽智SmartGel 140 等）
- 高速冷凍離心機(jī)（GL-21M 等）
- 高效液相色譜儀（紫外、熒光）（ Agilent1200 Series等）
- 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB SCIEX TRIPLE QUAD 5500、API 5000、QTRAP 4500、Triple QTOF 5600+等）
